Signatera® je individualizirani, tumor-informirani test namijenjen detekciji i praćenju cirkulirajućeg tumorskog DNK (ctDNA) u plazmi pacijenta. Za razliku od testova koji koriste fiksne genske panele, Signatera za svakog pacijenta dizajnira jedinstveni panel PCR početnica temeljen na somatskim varijantama identificiranima u tumorskom tkivu pacijenta.
1. Signatera® – Princip rada
Signatera koristi pristup tumor-informirane ctDNA analize koji uključuje sljedeće korake:
- provodi se sekvenciranje cijelog egzoma (Whole-Exome Sequencing, WES) tumorskog tkiva i germinalnog DNK pacijenta
- bioinformatičkom analizom identificira se i prioritizira veći broj somatskih varijanti
- iz identificiranog skupa varijanti odabire se do 16 klonalnih „high-confidence” SNV i indel varijanti specifičnih za tumor pojedinog pacijenta
- dizajnira se multiplex PCR panel (16-plex) s jedinstvenim molekularnim identifikatorima (UMI) za detekciju tih varijanti u plazmi.
Tako dizajniran test koristi se za praćenje istog tumora i nije namijenjen detekciji novih primarnih maligniteta.
2. Signatera® – Analitičke karakteristike
Analitička osjetljivost
95 % pri granici detekcije od 0,3 MTM/mL (≈ 0,01 % VAF, približno 1 mutacija na 10 000 normalnih DNK molekula).
Specifičnost
99,5 %
Kvantitativni rezultat
Rezultat se izražava kao prosječan broj tumorskih molekula po mililitru plazme (MTM/mL).
MTM/mL (mean tumor molecules per milliliter plazme) predstavlja procijenjeni broj tumorskih DNK molekula u uzorku plazme i koristi se za praćenje promjena kroz vrijeme.
U opisu analitičke osjetljivosti ponekad se navodi približna ekvivalentnost u varijantnoj alelnoj frekvenciji (VAF). VAF predstavlja relativni udio mutiranih DNK molekula u odnosu na ukupni DNK na određenoj genomskoj poziciji, dok MTM/mL predstavlja apsolutnu koncentraciju tumorskog DNK u plazmi.
Vrijednosti se ne uspoređuju između pacijenata te se interpretiraju u kliničkom kontekstu.
Ograničenja
- testiranje se ne preporučuje unutar dva tjedna nakon operacije
- rezultati se interpretiraju u kontekstu vremena uzorkovanja u odnosu na terapiju
- test nije namijenjen pacijentima nakon transplantacije koštane srži
- rezultati mogu biti pod utjecajem nedavne transfuzije krvi
3. Signatera® – Interpretacija rezultata
Signatera Positive
Detekcija ctDNA nakon operacije ili završetka liječenja povezana je s povećanim rizikom recidiva.
Signatera Negative
Odsutnost detektabilne ctDNA ukazuje na niži rizik recidiva, ali ne isključuje potpuno prisutnost bolesti.
Praćenje kroz vrijeme
Porast vrijednosti ctDNA tijekom vremena može biti povezan s povećanjem tumorskog opterećenja ili ranim recidivom.
4. Signatera® – Analitički proces i tehnološke značajke
Sekvenciranje i bioinformatika
WES tumora i germinalnog DNK omogućuje razlikovanje somatskih mutacija od nasljednih varijanti i tehničkih artefakata. Varijante visoke pouzdanosti („high-confidence”) odabiru se na temelju klonaliteta, detektabilnosti i čistoće uzorka.
Dizajn multiplex PCR panela
Iz identificiranog skupa somatskih varijanti odabire se do 16 klonalnih varijanti koje se koriste za dizajn individualnog PCR panela.
Za svakog pacijenta dizajnira se individualni set PCR početnica koje ciljaju odabrane somatske varijante.
UMI barcoding i ultra-duboko sekvenciranje
Amplikoni se označavaju jedinstvenim molekularnim barkodovima (UMI), nakon čega se provodi ultra-duboko sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) s dubinom sekvenciranja većom od 100 000×.
Ova kombinacija omogućuje smanjenje tehničkih pogrešaka i pouzdanu detekciju pojedinačnih molekula tumorskog DNK.
Detekcijski prag i pouzdanost
Granica detekcije Signatera testa (≈ 0,01 % VAF) niža je od granice detekcije većine drugih ctDNA testova (≈ 0,05–0,1 % VAF).
Algoritmi za filtriranje pogrešaka i korekciju oksidativnih artefakata povezani su s visokom specifičnošću (>99,5 %) i niskom stopom lažno pozitivnih nalaza (<0,5 %).
5. Signatera® – Interna baza podataka i validacija
Signatera ne koristi fiksni genetski panel, već se oslanja na internu bazu podataka koja uključuje:
- više od milijun sekvenciranih uzoraka
- više od 15 milijuna unikatnih somatskih varijanti iz različitih tipova tumora.
Ova baza podataka koristi se za:
- modeliranje klonalnosti tumora
- eliminaciju tehničkih i bioloških artefakata
- optimizaciju dizajna PCR panela za pojedinog pacijenta.
Signatera ima validacijski skup MRD podataka koji uključuje više od 10 000 pacijenata u kliničkim ispitivanjima.
6. Signatera® – Kliničke indikacije
Signatera je klinički validirana i koristi se za:
Praćenje minimalne rezidualne bolesti (MRD) i ranog recidiva kod:
- kolorektalnog karcinoma (CRC)
- mišićno-invazivnog karcinoma mokraćnog mjehura (MIBC)
- raka dojke (stadij IIb i viši)
- nemikrocelularnog raka pluća (NSCLC)
- karcinoma jajnika, jajovoda ili primarnog peritonealnog karcinoma.
Praćenje odgovora na terapiju, osobito kod bolesnika liječenih immune-checkpoint inhibitorima (ICI).
Praćenje bolesti kroz vrijeme tijekom i nakon liječenja.
7. Signatera® – Kliničko tumačenje i ograničenja
- Dobiveni rezultati odnose se na stanje u trenutku uzimanja uzorka.
- Negativan nalaz ne isključuje potpuno prisutnost malignih stanica.
- Test nije namijenjen detekciji germinalnih (nasljednih) mutacija niti procjeni nasljednog rizika za rak.
8. Signatera® – Usporedba s drugim ctDNA pristupima
| Značajka | Tumor-informirani ciljani panel (npr. Signatera) | Tumor-informirani WES/WGS pristup | ctDNA testovi s fiksnim genskim panelom |
|---|---|---|---|
| Dizajn testa | Individualni panel temeljen na mutacijama identificiranima u tumoru | Individualni pristup temeljen na sekvenciranju tumora (WGS) | Fiksni panel gena bez analize tumorskog tkiva |
| Potreban uzorak tumora | da | da | ne |
| Broj praćenih varijanti | do 16 klonalnih somatskih varijanti | veći broj varijanti identificiranih sekvenciranjem tumora | deseci do nekoliko stotina gena u panelu*** |
| Granica detekcije | ≈0,01 % VAF* | ≈0,1 % VAF** | ≈0,1-0,5 % VAF* |
| Specifičnost | vrlo visoka (>99 %) | visoka | niža zbog mogućih lažno pozitivnih nalaza |
| Prednost | visoka analitička specifičnost i osjetljivost za MRD | širi spektar mutacija | nije potreban uzorak tumorskog tkiva |
| Ograničenje | potreban uzorak tumora | složenija analiza i veći bioinformatički zahtjevi | veći rizik detekcije mutacija nepovezanih s tumorom |
U MRD analizi često se koristi manji broj pažljivo odabranih klonalnih mutacija, jer takav pristup omogućuje dublje sekvenciranje ciljanih lokusa i smanjuje vjerojatnost detekcije varijanti koje nisu povezane s tumorom.
*Chen K, Zhao H, Shi Y, Yang F, Wang LT, Kang G, et al.
Commercial ctDNA assays for minimal residual disease detection of solid tumors. Frontiers in Oncology. 2021;11:1-14.
* *Odegaard JI et al., Clinical Cancer Research, 2018
* *Clark TA et al., PLOS One, 2018
** Guardant360 technical validation papers
** *Wan JCM et al., Nat Rev Cancer 2017
***Heitzer E et al., Nat Rev Genet 2019
Zaključak
Signatera® je individualizirani test za molekularno praćenje minimalne rezidualne bolesti (MRD). Kombinacija sekvenciranja tumorskog egzoma, dizajna individualnog PCR panela i ultra-dubokog sekvenciranja omogućuje detekciju cirkulirajućeg tumorskog DNK uz vrlo nisku granicu detekcije i visoku analitičku specifičnost. Interna baza podataka i validacija na velikom broju pacijenata dio su analitičkog pristupa ovog testa.
